簡介​

水溶性維生素 (WSV) 主要由複合維生素 B 組成，是許多食品，尤其嬰兒配方奶粉的基本成分。這些維生素在代謝途徑中發揮著關鍵作用，日常飲食攝入可以產生顯著健康獲益。​

由於美國食品藥品監督管理局 (FDA) 製定了這些維生素的每日營養推薦值，因此食品和補充劑生產商以及獨立檢測實驗室需要能夠定量鑒定該類產品中的維生素含量。在進行強化食品分析時，由於維生素濃度範圍較廣，與每日容許攝取量保持一致尤其具有挑戰性 (見表 1)。例如，在嬰兒牛奶中，維生素 B12 (氰鈷維生素) 的濃度為 1-2ppb，而維生素 B2 (核黃素) 的濃度則高達 1000 倍 (1-2 pm)。因此，任何定量分析方法都必須能夠適應這種廣泛的濃度分布。

小黄鸭福利导航提出了一種 LC-MS/MS 方法，一次進樣即可定量分析 B 族維生素。分析的維生素包括維生素 B1 (硫胺素)、B2 (核黃素)、B3 (煙酸)、B3*(煙酰胺)、B6 (吡哆醇)、B7 (生物素)、B9 (葉酸) 和維生素 B12 (氰鈷胺)，使用三個內標。采用簡單的液液萃取法從嬰兒配方奶粉中提取維生素。樣品提取與快速分析方法 (<6 分鍾) 相結合具有穩定性 / 可靠性，並且耗時少。​

實驗​

硬件 / 軟件​

液相色譜串聯質譜分離使用 EClassical3200L-MS2Vertical 9100 液相質譜聯用係統，所有儀器控製、分析和數據處理均使用液質軟件平台執行。​

方法參數​

LC 和 MS/MS 方法參數分別見表 2 和表 3。

溶劑、標準品和樣品製備​

使用的所有溶劑、試劑和稀釋劑均為 HPLC 級，並通過 0.22-um 尼龍針頭式過濾器過濾。​

對於所有樣品的稀釋，使用 5-mM 甲酸銨，並用 10% 甲酸調整 pH 為 4.9。​

所有 B 族維生素標準品，包括 B1 (硫胺素)、B2 (核黃素)、B3 (煙酸)、B3*(煙酰胺)、B6 (吡哆醇)、B7 (生物素)、B9 (葉酸) 和 B12 (氰鈷胺) 均從 Sigma-Aldrich Inc.,Saint-Louis,MO. 購買。​

為了校準和定量，使用了三個內標：維生素 B1"(硫胺素；​13C4​C8​H17​ N4​OS+)、B7"(生物素；​C10​D2​H14​ N2​O3​ S) 和 B2'(核黃素；​13C4​C13​H2015​ N2​ N2​O6​))，全部來自 Sigma-Aldrich Inc.。校準 B3、B3*、B6 和 B1 時采用 B1'，校準 B7、B9 和 B12 時采用 B7，校準 B2 時采用 B2。​

分析樣品包括兩種商購獲得的嬰兒配方奶粉，標記為 IF1 和 IF2。​

為了防止可能的標準品或樣品不穩定性，所有儲備和工作標準品均冷藏存儲，直到使用；所有製備樣品均在 4 小時內進行分析，並且隻使用琥珀色 2mL LC 小瓶。​

所有標準品和樣品均通過 0.22-um 尼龍過濾器過濾。​

實驗​

標準品製備​

在 250mL 容量瓶中製備 40ug/mL 的 B2、B9 和 B7 儲備標準品。由於這三種維生素在堿性條件下溶解佳，所以首先在燒瓶中加入 50mL0.05% 氫氧化銨​(NH4​OH)，搖晃直到標準品完全溶解。然後加入稀釋劑，定容至刻度。​

直接使用稀釋劑製備 40ug/mL 的 B3、B3*、B6 和 B1 儲備標準品和 5pg/mL 的 B12 儲備標準品。​

對於工作標準品，向 100mL 容量瓶中加入三種儲備液各 25mL 以及 25mL 稀釋劑。搖晃後，將燒瓶冷藏。本工作標準品也作為校正濃度級別 6 的標準溶液，除 B12 (1.50ug/mL) 外，各維生素含量均為 10pg/mL。​

加入各同位素的維生素標準純品，製備內標儲備液 (ISTD)，如下：將 2mg 的 B1、5mg 的 B7 和 1mg 的 B2 分別轉移到 20mL、250mL 和 10mL 容量瓶中。為了輔助溶解，首先將 B1 和 B2' 標準品轉移到每個容量瓶，用 1mL 0.05%​NH4​OH分 5 次潤洗。然後用稀釋劑分別將三個容量瓶定容至標線。獲得的 B1 和 B2 儲備濃度為 10ug/mL，B7 為 20pg/mL。​

通過對工作標準品進行連續稀釋，製備 6 個校準濃度級別。獲得的維生素濃度見表 4。由於維生素 B12 的 DV 指南值明顯較低 (0.006mg)，因此使用較低的濃度範圍對其進行校準。每批樣品運行前，分別移取各校準濃度級別標準溶液 50mL 至 50mL 容量瓶中，加入 50μL ISTD B1、B2 和 250μL ISTD B7，使內標濃度為 0.1ug/mL。注：如果可用的任何校準濃度級別標準溶液低於 50mL，ISTD 應相對可用量成比例添加。所有校準物均一式三份進樣。​

樣品製備​

在皮重 50mL 離心管中稱取所需量，然後加入 20mL 稀釋劑，製備兩種嬰兒配方奶粉 (標記為 IF1 和 IF2)。所需量根據每種產品標示量中奶粉與水的建議比例確定。每個離心管脈衝渦旋 15 分鍾，加入 ISTD B1 和 B2'40μL 以及 ISTD B7'200μL，使內標濃度為 0.2ug/ml，樣品中內標加標至 0.2ug/mL，在接下來樣品製備過程中，內標濃度將被稀釋 2 倍。​

取 20mL 乙腈，用 10μL 的 10% 甲酸酸化，然後加入每個試管。隨後脈衝渦旋 5 分鍾，以 7800rpm 離心分離 10 分鍾。加入酸化的 ACN 引起蛋白質沉澱 / 澱析，從而可以通過離心除去脂肪 / 固體物質。然後從三個試管中分別小心地轉移 10.0mL 上清液到 50mL 離心管中，並幹燥至約 mL。然後，每管中裝入稀釋劑至 10mL 刻度，脈衝渦旋 3 分鍾，並以 7800rpm 離心 5 分鍾。各取 1mL 上清液過濾到 2mL 小瓶中。所有樣品一式三份進樣。​

結果和討論​

使用規定的方法參數，圖 1 顯示了重複進樣 12 次濃度級別 5 的標準溶液各 MRM 通道的譜圖疊加。所有 8 種維生素均有良好分離度，在不到 4 分鍾內洗脫，重複進樣 12 針的譜圖疊加，展現出了的色譜重現性。​

圖 2 顯示了維生素 B1 和 B12 的校準曲線，表現出的線性 (​R2≥0.999；​n=3)。維生素 B2、B3*、B7 和 B12 采用 6 級校準。對於維生素 B1、B3、B6 和 B9，使用 5 級校準。所有 8 種維生素的​R2>0.996。

注：更多詳情 請下載 PDF 文件查看。